Produkti
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR noteikšanas komplekts 2019-nCoV
Paredzamais lietojums
Šis komplekts tiek izmantots jauna koronavīrusa (2019-nCoV) kvalitatīvai noteikšanai, izmantojot rīkles tamponus, nazofarneksa uztriepes, bronhoalveolāro skalošanas šķidrumu, krēpu. Šī produkta noteikšanas rezultāts ir tikai klīniskai atsaucei, un to nevajadzētu izmantot kā vienīgo. pierādījumi klīniskai diagnozei un ārstēšanai.Ieteicama visaptveroša stāvokļa analīze kopā ar pacienta klīniskajām izpausmēm un citiem laboratorijas testiem.
Pārbaudes princips
Komplekts ir balstīts uz vienpakāpju RT-PCR tehnoloģiju.Faktiski 2019. gada jaunie koronavīrusa (2019-nCoV) ORF1ab un N gēni tika izvēlēti kā amplifikācijas mērķa reģioni.Specifiski praimeri un fluorescējošās zondes (N gēna zondes ir marķētas ar FAM un ORF1ab zondes ir marķētas ar HEX) ir izstrādātas, lai paraugos noteiktu 2019. gada jaunā tipa koronavīrusa RNS.Komplektā ietilpst arī endogēna iekšējās kontroles noteikšanas sistēma (iekšējās kontroles gēna zonde, kas marķēta ar CY5), lai uzraudzītu paraugu savākšanas, RNS un PCR amplifikācijas procesu, tādējādi samazinot viltus negatīvos rezultātus.
Galvenās sastāvdaļas
| Sastāvdaļas | Skaļums(48T/Kit) |
| RT-PCR reakcijas šķīdums | 96 µl |
| nCOV primer TaqMan zondes maisījums (ORF1ab, N gēns, RnaseP gēns) | 864 µl |
| Negatīvā kontrole | 1500 µl |
| nCOV pozitīvā kontrole (l ORF1ab N gēns) | 1500 µl |
Pašu reaģenti: RNS ekstrakcijas vai attīrīšanas reaģenti.Negatīvā/pozitīvā kontrole: Pozitīvā kontrole ir RNS, kas satur mērķa fragmentu, savukārt negatīvā kontrole ir ūdens, kas nesatur nukleīnskābi.Lietošanas laikā tiem ir jāpiedalās ekstrakcijā un jāuzskata par infekcioziem.Tie ir jārīkojas un jāiznīcina saskaņā ar attiecīgajiem noteikumiem.
Iekšējais atsauces gēns ir cilvēka RnaseP gēns.
Uzglabāšanas nosacījumi un derīguma termiņš
-20±5 ℃, izvairieties no atkārtotas sasaldēšanas un atkausēšanas vairāk nekā 5 reizes, derīga 6 mēnešus.
Piemērojamais instruments
Ar FAM / HEX / CY5 un citu daudzkanālu fluorescējošu PCR instrumentu.
Prasības paraugiem
1. Piemērojamie paraugu veidi: rīkles tamponi, nazofaringeālie uztriepes, bronhoalveolārais skalošanas šķidrums, krēpas.
2. Paraugu ņemšana (aseptiska tehnika)
Rīkles tampons: vienlaikus noslaukiet mandeles un rīkles aizmugurējo sienu ar diviem tamponiem, pēc tam iemērciet tampona galvu mēģenē, kurā ir parauga ņemšanas šķīdums.
Krēpas: pēc tam, kad pacientam ir dziļš klepus, savāciet atklepotās krēpas skrūvējamā mēģenē, kurā ir parauga ņemšanas šķīdums;Bronhoalveolārais skalošanas šķidrums: paraugu ņemšana, ko veic medicīnas speciālisti.3.Paraugu uzglabāšana un transportēšana
Paraugi vīrusa izolācijai un RNS testēšanai ir jāpārbauda pēc iespējas ātrāk.Paraugus, kurus var noteikt 24 stundu laikā, var uzglabāt 4℃ temperatūrā;tās, kuras nevar noteikt 24. gadā
stundas jāuzglabā -70 ℃ vai zemākā temperatūrā (ja nav uzglabāšanas nosacījuma -70 ℃, tām jābūt
īslaicīgi uzglabāts -20 ℃ ledusskapī).Transportēšanas laikā paraugiem jāizvairās no atkārtotas sasaldēšanas un atkausēšanas.Paraugi jānosūta uz laboratoriju pēc iespējas ātrāk pēc savākšanas.Ja paraugi ir jāpārvadā lielos attālumos, ieteicams uzglabāt sauso ledu.
Pārbaudes metodes
1 paraugu apstrāde un RNS ekstrakcija (paraugu apstrādes zona)
RNS ekstrakcijai ieteicams ņemt 200μl šķidra parauga.Saistītās ekstrakcijas darbības skatiet komerciālo RNS ekstrakcijas komplektu instrukcijās.Gan negatīvais, gan negatīvais
ekstrahēšanā tika iesaistīti šī komplekta kontroles elementi.
2 PCR reaģenta sagatavošana (reaģenta sagatavošanas zona)
2.1 Izņemiet visas sastāvdaļas no komplekta un atkausējiet un samaisiet istabas temperatūrā.Pirms lietošanas dažas sekundes centrifugējiet ar ātrumu 8000 apgr./min;aprēķina nepieciešamo reaģentu daudzumu un reakcijas sistēmu sagatavo, kā parādīts šajā tabulā:
| Sastāvdaļas | N porcija (25 µl sistēma) |
| nCOV primer TaqMan zondes maisījums | 18 µl × N |
| RT-PCR reakcijas šķīdums | 2 µl × N |
| *N = pārbaudīto paraugu skaits + 1 (negatīvā kontrole) + 1 (nCOVpozitīva kontrole) | |
2.2. Pēc rūpīgas komponentu sajaukšanas īsu laiku centrifugējiet, lai ļautu visam šķidrumam uz mēģenes sienas nokrist mēģenes apakšā, un pēc tam sadaliet 20 µl amplifikācijas sistēmu PCR mēģenē.
3 Paraugu ņemšana (paraugu sagatavošanas zona)
Pēc ekstrakcijas pievieno 5 μl negatīvās un pozitīvās kontroles.Pārbaudāmā parauga RNS pievieno PCR reakcijas mēģenei.
Cieši aizveriet mēģeni un centrifugējiet ar ātrumu 8000 apgr./min dažas sekundes, pirms to pārvietojat uz amplifikācijas noteikšanas zonu.
4 PCR amplifikācija (pastiprināta noteikšanas zona)
4.1. Ievietojiet reakcijas mēģeni instrumenta parauga kamerā un iestatiet parametrus šādi:
| posms | Cikls numuru | Temperatūra(°C) | Laiks | kolekcijavietne |
| Reversstranskripcija | 1 | 42 | 10 min | - |
| Pirmsdenaturācijan | 1 | 95 | 1 min | - |
| Cikls | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30. gadi | datu vākšana |
Instrumenta noteikšanas kanāla izvēle: atlasiet fluorescences signāla kanālu FAM、HEX、CY5.Atsauces fluorescējošajam NONE, lūdzu, neizvēlieties ROX.
5 Rezultātu analīze (Iestatīšanai, lūdzu, skatiet katra instrumenta eksperimentālos norādījumus)
Pēc reakcijas saglabājiet rezultātus.Pēc analīzes noregulējiet bāzes līnijas sākuma vērtību, beigu vērtību un sliekšņa vērtību atbilstoši attēlam (lietotājs var pielāgot atbilstoši faktiskajai situācijai, sākuma vērtību var iestatīt uz 3 ~ 15, beigu vērtību var iestatīt uz 5~20, korekcija) logaritmiskajā grafikā Pie loga sliekšņa sliekšņa līnija atrodas logaritmiskajā fāzē, un negatīvās kontroles pastiprināšanas līkne ir taisna līnija vai zem sliekšņa līnijas).
6 Kvalitātes kontrole (Pārbaudē ir iekļauta procedūras kontrole) Negatīvā kontrole: nav acīmredzamas pastiprināšanas līknes FAM, HEX, CY5 noteikšanas kanāliem.
COV pozitīvā kontrole: acīmredzama FAM un HEX noteikšanas kanālu pastiprināšanas līkne, Ct vērtība≤32, bet nav CY5 kanāla pastiprināšanas līknes;
Iepriekš minētās prasības vienā un tajā pašā eksperimentā ir jāizpilda vienlaikus;pretējā gadījumā eksperiments ir nederīgs un ir jāatkārto.
7 Rezultātu noteikšana.
7.1. Ja testa parauga FAM un HEX kanālos nav amplifikācijas līknes vai Ct vērtība > 40, bet CY5 kanālā ir amplifikācijas līkne, var spriest, ka 2019. gada jauna koronavīrusa (2019-nCoV) nav. RNS paraugā;
.2 Ja testa paraugam ir acīmredzamas amplifikācijas līknes FAM un HEX kanālos un Ct vērtība ir ≤40, var spriest, ka paraugs ir pozitīvs attiecībā uz 2019. gada jauno koronavīrusu (2019-nCoV).
7.3. Ja testa paraugam ir skaidra pastiprināšanas līkne tikai vienā FAM vai HEX kanālā un Ct vērtība ir ≤40, bet otrā kanālā nav pastiprināšanas līknes, rezultāti ir jāpārbauda atkārtoti.Ja atkārtotās pārbaudes rezultāti ir konsekventi, var uzskatīt, ka paraugs ir pozitīvs jaunajam
koronavīruss 2019 (2019-nCoV).Ja atkārtotā testa rezultāts ir negatīvs, var spriest, ka paraugs ir negatīvs attiecībā uz 2019. gada jauno koronavīrusu (2019-nCoV).
Pozitīva sprieduma vērtība
ROC līknes metodi izmanto, lai noteiktu komplekta atsauces CT vērtību, un iekšējās kontroles atsauces vērtība ir 40.
Pārbaudes rezultātu interpretācija
1. Katrs eksperiments ir jāpārbauda attiecībā uz negatīvām un pozitīvajām kontrolēm.Testa rezultātus var noteikt tikai tad, ja kontroles atbilst kvalitātes kontroles prasībām
2. Ja FAM un HEX noteikšanas kanāli ir pozitīvi, CY5 kanāla (iekšējā kontroles kanāla) rezultāts var būt negatīvs sistēmas konkurences dēļ.
3. Ja iekšējās kontroles rezultāts ir negatīvs, ja arī mēģenes FAM un HEX noteikšanas kanāli ir negatīvi, tas nozīmē, ka sistēma ir atspējota vai darbība ir nepareiza, t tests ir nederīgs.Tāpēc paraugi ir jāpārbauda atkārtoti.
