Produkti
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR noteikšanas komplekts 2019-nCoV
Paredzētais lietojums
Šis komplekts tiek izmantots jaunā koronavīrusa (2019-nCoV) kvalitatīvai noteikšanai, izmantojot rīkles uztriepes, nazofaringeālas uztriepes, bronhoalveolārās skalošanas šķidrumu un krēpas. Šī produkta noteikšanas rezultāts ir paredzēts tikai klīniskai uzziņai, un to nevajadzētu izmantot kā vienīgo pierādījumu klīniskajai diagnozei un ārstēšanai. Ieteicama visaptveroša stāvokļa analīze kombinācijā ar pacienta klīniskajām izpausmēm un citiem laboratorijas testiem.
Pārbaudes princips
Komplekts ir balstīts uz vienas pakāpes RT-PCR tehnoloģiju. Faktiski 2019. gada jaunā koronavīrusa (2019-nCoV) ORF1ab un N gēni tika izvēlēti kā amplifikācijas mērķa reģioni. Specifiski primeri un fluorescējošas zondes (N gēna zondes ir marķētas ar FAM, un ORF1ab zondes ir marķētas ar HEX) ir paredzēti, lai noteiktu 2019. gada jaunā tipa koronavīrusa RNS paraugos. Komplektā ietilpst arī endogēna iekšējās kontroles noteikšanas sistēma (iekšējās kontroles gēna zonde, kas marķēta ar CY5), lai uzraudzītu paraugu savākšanas, RNS un PCR amplifikācijas procesu, tādējādi samazinot viltus negatīvus rezultātus.
Galvenās sastāvdaļas
| Sastāvdaļas | Apjoms()48T/komplekts) |
| RT-PCR reakcijas šķīdums | 96 µl |
| nCOV primer TaqMan zondes maisījums (ORF1ab, N gēns, RnaseP gēns) | 864 µl |
| Negatīvā kontrole | 1500 µl |
| nCOV pozitīva kontrole (l ORF1ab N gēns) | 1500 µl |
Pašu reaģenti: RNS ekstrakcijas vai attīrīšanas reaģenti. Negatīvā/pozitīvā kontrole: Pozitīvā kontrole ir RNS, kas satur mērķa fragmentu, savukārt negatīvā kontrole ir nukleīnskābju nesaturošs ūdens. Lietošanas laikā tiem jāpiedalās ekstrakcijā un tie jāuzskata par infekcioziem. Ar tiem jāapietas un tie jāiznīcina saskaņā ar attiecīgajiem noteikumiem.
Iekšējais atsauces gēns ir cilvēka RnaseP gēns.
Uzglabāšanas apstākļi un derīguma termiņš
-20 ± 5 ℃, izvairieties no atkārtotas sasaldēšanas un atkausēšanas vairāk nekā 5 reizes, derīgs 6 mēnešus.
Piemērojamais instruments
Ar FAM/HEX/CY5 un citiem daudzkanālu fluorescējošiem PCR instrumentiem.
Parauga prasības
1. Piemērojamie paraugu veidi: rīkles uztriepes, nazofaringeālas uztriepes, bronhoalveolārā skalošanas šķidrums, krēpas.
2.Paraugu savākšana (aseptiska tehnika)
Rīkles uztriepe: Vienlaikus noslaukiet mandeles un rīkles aizmugurējo sienu ar diviem uztriepes gabaliņiem, pēc tam iegremdējiet uztriepes gabaliņa galviņu mēģenē ar parauga šķīdumu.
Krēpas: Pēc tam, kad pacientam ir dziļš klepus, savāciet atklepotās krēpas skrūvējama vāciņa mēģenē, kurā ir parauga šķīdums; bronhoalveolārās skalošanas šķidrums: paraugu ņemšanu veic medicīnas speciālisti. 3. Paraugu uzglabāšana un transportēšana
Vīrusu izolēšanai un RNS testēšanai paredzētie paraugi jātestē pēc iespējas ātrāk. Paraugus, kurus var noteikt 24 stundu laikā, var uzglabāt 4 °C temperatūrā; tos, kurus nevar noteikt 24 stundu laikā,
stundas jāuzglabā -70 ℃ vai zemākā temperatūrā (ja nav uzglabāšanas apstākļu -70 ℃, tās ir jāuzglabā
(īslaicīgi uzglabāts ledusskapī -20 ℃ temperatūrā). Paraugi transportēšanas laikā jāizvairās no atkārtotas sasaldēšanas un atkausēšanas. Paraugi jānosūta uz laboratoriju pēc iespējas ātrāk pēc savākšanas. Ja paraugi ir jāpārvadā lielos attālumos, ieteicams tos uzglabāt sausajā ledū.
Testa metodes
1. Parauga apstrāde un RNS ekstrakcija (parauga apstrādes zona)
RNS ekstrakcijai ieteicams ņemt 200 μl šķidra parauga. Saistītās ekstrakcijas darbības skatiet komerciālo RNS ekstrakcijas komplektu instrukcijās. Gan negatīvais, gan negatīvais
Ekstrakcijā bija iesaistītas šī komplekta kontroles.
2. PCR reaģenta sagatavošana (reaģenta sagatavošanas zona)
2.1 Izņemiet visas sastāvdaļas no komplekta, atkausējiet un samaisiet istabas temperatūrā. Pirms lietošanas dažas sekundes centrifugējiet ar ātrumu 8000 apgr./min; aprēķiniet nepieciešamo reaģentu daudzumu un sagatavojiet reakcijas sistēmu, kā parādīts šajā tabulā:
| Sastāvdaļas | N porcija (25 µl sistēma) |
| nCOV primer TaqMan zondes maisījums | 18 µl × N |
| RT-PCR reakcijas šķīdums | 2 µl × N |
| *N = testēto paraugu skaits + 1 (negatīvā kontrole) + 1 (nCOVpozitīva kontrole) | |
2.2 Pēc komponentu rūpīgas sajaukšanas īsu brīdi centrifugējiet, lai viss šķidrums no mēģenes sieniņas notektu mēģenes apakšā, un pēc tam 20 µl amplifikācijas sistēmas iepildiet PCR mēģenē.
3 Paraugu ņemšana (parauga sagatavošanas zona)
Pēc ekstrakcijas pievienojiet 5 μl negatīvās un pozitīvās kontroles. Testējamā parauga RNS pievieno PCR reakcijas mēģenei.
Cieši aizveriet mēģeni un centrifugējiet ar ātrumu 8000 apgr./min dažas sekundes, pirms pārvietošanas uz amplifikācijas noteikšanas zonu.
4. PCR amplifikācija (amplificētā noteikšanas zona)
4.1 Ievietojiet reakcijas mēģeni instrumenta parauga kamerā un iestatiet parametrus šādi:
| skatuve | Cikls skaitlis | Temperatūra(°C) | Laiks | kolekcijavietne |
| Reversstranskripcija | 1 | 42 | 10 minūtes | - |
| Pirmsdenaturācijan | 1 | 95 | 1 minūte | - |
| Cikls | 45 | 95 | 15 sekundes | - |
| 60 | 30. gados | datu vākšana |
Instrumenta noteikšanas kanāla izvēle: Fluorescences signālam atlasiet kanālu FAM, HEX, CY5. Atsauces fluorescences signālam NONE, lūdzu, neizvēlieties ROX.
5 Rezultātu analīze (Lūdzu, skatiet katra instrumenta eksperimentālās instrukcijas par iestatīšanu)
Pēc reakcijas saglabājiet rezultātus. Pēc analīzes logaritmiskajā grafikā atbilstoši attēlam pielāgojiet bāzes līnijas sākuma vērtību, beigu vērtību un robežvērtību (lietotājs var pielāgot atbilstoši faktiskajai situācijai, sākuma vērtību var iestatīt uz 3–15, beigu vērtību var iestatīt uz 5–20). Pie loga sliekšņa sliekšņa līnija atrodas logaritmiskajā fāzē, un negatīvās kontroles amplifikācijas līkne ir taisna līnija vai zem sliekšņa līnijas.
6. Kvalitātes kontrole (testā ir iekļauta procedūras kontrole). Negatīvā kontrole: FAM, HEX, CY5 noteikšanas kanāliem nav acīmredzamas amplifikācijas līknes.
COV pozitīvā kontrole: FAM un HEX noteikšanas kanālu amplifikācijas līkne ir acīmredzama, Ct vērtība ≤ 32, bet CY5 kanāla amplifikācijas līknes nav;
Iepriekš minētās prasības jāizpilda vienlaicīgi vienā eksperimentā; pretējā gadījumā eksperiments nav derīgs un ir jāatkārto.
7 Rezultātu noteikšana.
7.1 Ja testa parauga FAM un HEX kanālos nav amplifikācijas līknes vai Ct vērtība ir > 40, un CY5 kanālā ir amplifikācijas līkne, var secināt, ka paraugā nav 2019. gada jaunā koronavīrusa (2019-nCoV) RNS;
.2 Ja testa paraugam ir acīmredzamas amplifikācijas līknes FAM un HEX kanālos un Ct vērtība ir ≤40, var secināt, ka paraugs ir pozitīvs attiecībā uz 2019. gada jauno koronavīrusu (2019-nCoV).
7.3 Ja testa paraugam ir skaidra amplifikācijas līkne tikai vienā FAM vai HEX kanālā un Ct vērtība ir ≤40, un otrā kanālā nav amplifikācijas līknes, rezultāti ir jāpārbauda atkārtoti. Ja atkārtotās pārbaudes rezultāti ir konsekventi, paraugu var uzskatīt par pozitīvu attiecībā uz jauno.
2019. gada koronavīruss (2019-nCoV). Ja atkārtotas pārbaudes rezultāts ir negatīvs, var uzskatīt, ka paraugs ir negatīvs attiecībā uz 2019. gada jauno koronavīrusu (2019-nCoV).
Pozitīva sprieduma vērtība
Komplekta references CT vērtības noteikšanai tiek izmantota ROC līknes metode, un iekšējās kontroles references vērtība ir 40.
Testa rezultātu interpretācija
1. Katrs eksperiments ir jāpārbauda attiecībā uz negatīvām un pozitīvām kontrolēm. Testa rezultātus var noteikt tikai tad, ja kontroles atbilst kvalitātes kontroles prasībām.
2. Ja FAM un HEX noteikšanas kanāli ir pozitīvi, CY5 kanāla (iekšējā kontroles kanāla) rezultāts var būt negatīvs sistēmas konkurences dēļ.
3. Ja iekšējās kontroles rezultāts ir negatīvs un arī mēģenes FAM un HEX noteikšanas kanāli ir negatīvi, tas nozīmē, ka sistēma ir atspējota vai darbība ir nepareiza, t tests ir nederīgs. Tādēļ paraugi ir jāpārbauda atkārtoti.
